Reife tRNAs tragen am 3′-Ende ein CCA-Triplett, welches eine wesentliche Voraussetzung für die Aminoacylierung und Translation ist. In den meisten Organismen ist dieses Triplett nicht in den tRNA-Genen codiert und muss posttranskriptional durch ATP(CTP):tRNA-Nukleotidyltransferasen (CCA-addierende Enzyme) eingebaut werden. Erstaunlicherweise wird diese Reaktion mit sehr hoher Genauigkeit katalysiert, obwohl keine Nukleinsäurevorlage beteiligt ist.
Die meisten Organismen verfügen über ein einziges CCA-addierendes Enzym, das sowohl zytosolische als auch mitochondriale tRNAs verarbeiten muss. Interessanterweise fehlen bei einigen Organismen den mitochondrialen tRNAs der D- oder der T-Arm oder sogar beide. Wir untersuchen, wie sich CCA-addierende Enzyme entwickelt haben, um sich an solche bizarren und armlosen tRNAs anzupassen, und wie sie in der Lage sind, das vollständige CCA-Triplett an solche abnormen Substrate korrekt zu addieren.
Wir erforschen die enzymatischen Eigenschaften der urzeitlichen tRNA-Nukleotidyltransferasen und ihre Entwicklung zu modernen Enzymen. Gemeinsam mit unseren Kooperationspartnern untersuchen wir rekonstruierte Vorfahren von CCA-addierenden Enzymen aus Gammaproteobakterien, die wir rekombinant für in vivo und in vitro Studien exprimieren, wo wir die Substratspezifität, die Polymerisationsgeschwindigkeit und andere enzymatische Eigenschaften untersuchen.
Da Eukaryoten das 3′-CCA-Ende in ihren tRNA-Genen nicht kodieren, sind tRNA-Nukleotidyltransferasen in diesen Organismen unerlässlich. Unsere Analyse einer Reihe von Gensequenzen, die für eukaryotische tRNA-Nukleotidyltransferasen codieren, zeigte das Vorkommen mehrerer Gene in bestimmten Organismen wie Amöben, Pilzen und Choanoflagellaten. Wir untersuchen die Funktion, Aktivität und Evolution dieser multiplen Enzyme.
Aufgrund der sehr unterschiedlichen Eigenschaften von tRNA-Nukleotidyltransferasen aus allen Bereichen des Lebens sind robuste Methoden für ihre Analyse notwendig. Eine vergleichende in vivo Charakterisierung hat dabei viele Vorteile gegenüber in vitro Ansätzen, da die katalytische Effizienz unter natürlichen Bedingungen untersucht werden kann. Darüber hinaus ermöglichen In-vivo-Systeme die Entwicklung von Proteinen durch semi-rationales Design. Wir haben ein auf E. coli basierendes System entwickelt, bei dem ein Wirtsstamm verwendet wird, dem das endogene CCA-addierende Enzym fehlt, um unerwünschte Hintergrundaktivitäten zu unterdrücken. Dieser Ansatz ist sowohl für das Screening als auch für die Auswahl von Enzymvarianten sehr nützlich, und wir sind in der Lage, die Auswirkungen der Enzyme auf die zelluläre Fitness auf unkomplizierte Weise zu überwachen.